今天小(xiao)編(bian)給大家(jia)簡述一下流式(shi)細胞儀檢(jian)測的(de)(de)工作(zuo)原(yuan)理，希(xi)望對(dui)您的(de)(de)實驗(yan)工作(zuo)有所幫助！

儀器設(she)備：

在流式(shi)細(xi)胞術中使用的儀(yi)器(qi)稱(cheng)為流式(shi)細(xi)胞分(fen)析儀(yi)，通常縮(suo)寫為“細(xi)胞分(fen)析儀(yi)"。流式(shi)細(xi)胞分(fen)析儀(yi)由一(yi)個(ge)用于(yu)進行細(xi)胞處理(li)的流體系統(tong)和一(yi)個(ge)包括數(shu)據采集信號檢測器(qi)和處理(li)器(qi)的光學系統(tong)組成。專為 FACS 設計的儀(yi)器(qi)還(huan)包含一(yi)個(ge)細(xi)胞分(fen)選組件，該組件可(ke)將細(xi)胞引導到不同的捕獲(huo)容器(qi)中。

流體(ti)系(xi)統設計用(yong)(yong)(yong)于生成單細(xi)(xi)胞(bao)的(de)均勻流，以確保當細(xi)(xi)胞(bao)被用(yong)(yong)(yong)于檢測的(de)光源照射(she)時，能夠進行適當分析。這通(tong)過(guo)(guo)使用(yong)(yong)(yong)加(jia)壓管將細(xi)(xi)胞(bao)從樣品管注(zhu)入流室中(zhong)來(lai)完成。從容(rong)器（通(tong)常是一根(gen)試管或一塊多孔(kong)板）中(zhong)抽取細(xi)(xi)胞(bao)樣品，并將其注(zhu)入流動液(ye)體(ti)（稱為鞘液(ye)）層流中(zhong)間(jian)的(de)流室中(zhong)。通(tong)過(guo)(guo)一個稱為流體(ti)動力學聚焦的(de)流程，鞘液可幫助(zhu)縮窄細(xi)胞(bao)流，從(cong)而將細(xi)胞(bao)組(zu)織成(cheng)一行大(da)致單行的(de)流線。

流式細胞(bao)分(fen)析(xi)儀的光(guang)學系統包括照明(ming)源、過濾器、透(tou)鏡和收集(ji)光(guang)學器件。照明(ming)源常(chang)包括 1 個(ge)或多(duo)個(ge)激(ji)光(guang)束，且(qie)每個(ge)激(ji)光(guang)器發射的光(guang)波(bo)長不同。檢測(ce)器不區分(fen)各(ge)種光(guang)波(bo)長，而是通過放置在(zai)光(guang)路徑中(zhong)的過濾器來將光(guang)限制在(zai)所需波(bo)長范(fan)圍內。

相關試(shi)劑：

   為了通(tong)過流式細(xi)胞(bao)(bao)術分(fen)析(xi)特定(ding)靶(ba)標(biao)，對(dui)細(xi)胞(bao)(bao)組分(fen)進行熒光標(biao)記。這可(ke)以(yi)通(tong)過使用單獨的(de)熒光分(fen)子(zi)（例如，細(xi)胞(bao)(bao)染料）或熒光團標(biao)記的(de)抗體（直接偶聯(lian)抗體或使用偶聯(lian)二抗）來完成。

1.流式(shi)細(xi)胞(bao)術中抗體的(de)使用

抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)是許多(duo)生物檢(jian)(jian)測(ce)中(zhong)的(de)關鍵工具(ju)，在流(liu)式細(xi)胞術中(zhong)也不例外(wai)。抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)具(ju)有特異(yi)性結(jie)合單個蛋白或蛋白修飾的(de)能(neng)力，并且可(ke)作為一種(zhong)方法(fa)來(lai)標記(ji)那些用于進(jin)行(xing)檢(jian)(jian)測(ce)的(de)靶標。通過(guo)標記(ji)目的(de)靶標，研究(jiu)人員可(ke)以(yi)評估各種(zhong)細(xi)胞類型、疾病狀態、治療條(tiao)件、發育階段或其他(ta)生物模型中(zhong)蛋白的(de)豐度或活性。與不同(tong)蛋白結(jie)合的(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)不會相互(hu)干(gan)擾，因此，可(ke)以(yi)使用多(duo)種(zhong)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)同(tong)時檢(jian)(jian)測(ce)多(duo)個靶標。這稱為多(duo)重分(fen)(fen)析。抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)數量的(de)限制是獨立于其他(ta)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)測(ce)定(ding)每種(zhong)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)的(de)能(neng)力。在流(liu)式細(xi)胞術中(zhong)，這種(zhong)差(cha)分(fen)(fen)測(ce)定(ding)使用稱為熒(ying)光(guang)(guang)團(tuan)的(de)熒(ying)光(guang)(guang)分(fen)(fen)子來(lai)完(wan)成。成功(gong)的(de)實(shi)驗(yan)要求具(ju)有高度特異(yi)性和經驗(yan)證的(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)以(yi)及可(ke)靠(kao)的(de)熒(ying)光(guang)(guang)團(tuan)。

2.流式細胞術中(zhong)熒光團的使用

熒光團的(de)共同(tong)特性是能(neng)夠發射(she)與用(yong)于照(zhao)(zhao)亮染料的(de)光相比波(bo)長(chang)更長(chang)的(de)光。例如(ru)，如(ru)果使用(yong)藍色激(ji)光器來照(zhao)(zhao)亮稱為綠色熒光蛋白(bai) (GFP) 的(de)分子，那么蛋白(bai)會吸收藍光并發射(she)綠光。被吸收的(de)光與被發射(she)的(de)光之間的(de)波(bo)長(chang)差(cha)異稱為斯托(tuo)克斯位移(yi)。

就是這(zhe)種位移(yi)讓人(ren)們能夠準(zhun)確定量來(lai)自熒(ying)光(guang)(guang)團的(de)光(guang)(guang)，因為它能夠過濾來(lai)自激發(fa)源的(de)光(guang)(guang)的(de)波長。激發(fa)源總是比從正在分析的(de)熒(ying)光(guang)(guang)團中發(fa)射的(de)熒(ying)光(guang)(guang)更亮些，并且如(ru)果這(zhe)種光(guang)(guang)無法移(yi)除，那么它將(jiang)會強烈影響檢(jian)測器。

熒(ying)光染料吸(xi)收(shou)的(de)光的(de)范圍稱(cheng)為“激(ji)發(fa)"光譜(pu)，而激(ji)發(fa)時其發(fa)出(chu)的(de)熒(ying)光稱(cheng)為“發(fa)射(she)"光譜(pu)。激(ji)發(fa)和發(fa)射(she)光譜(pu)針對所有常見(jian)染料提供(gong)，并呈曲(qu)線顯示各波長下吸(xi)收(shou)或發(fa)射(she)的(de)光量。

3.偶聯抗(kang)體

通(tong)常，在流式細(xi)胞(bao)(bao)(bao)術實(shi)驗中用(yong)于獲取讀數的(de)熒光(guang)(guang)團會(hui)與抗(kang)體共(gong)價結合。該過程(cheng)稱(cheng)(cheng)為偶(ou)(ou)(ou)聯，并且(qie)該抗(kang)體-熒光(guang)(guang)團配(pei)對(dui)稱(cheng)(cheng)為偶(ou)(ou)(ou)聯物(wu)。當在一(yi)項(xiang)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)檢(jian)測(ce)(ce)中使用(yong)偶(ou)(ou)(ou)聯抗(kang)體時，熒光(guang)(guang)團發射的(de)光(guang)(guang)可作為細(xi)胞(bao)(bao)(bao)內或(huo)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)上存在的(de)抗(kang)體量的(de)一(yi)個直(zhi)(zhi)接指標。（由于細(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜是透光(guang)(guang)的(de)，細(xi)胞(bao)(bao)(bao)內熒光(guang)(guang)團發射的(de)光(guang)(guang)不會(hui)顯著衰減。）通(tong)過使用(yong)特異性結合蛋白或(huo)蛋白修飾的(de)偶(ou)(ou)(ou)聯物(wu)，研究人員可以根據每(mei)個細(xi)胞(bao)(bao)(bao)發射的(de)熒光(guang)(guang)水平，直(zhi)(zhi)接量化該細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中的(de)目的(de)靶標。該過程(cheng)稱(cheng)(cheng)為直(zhi)(zhi)接檢(jian)測(ce)(ce)或(huo)直(zhi)(zhi)接流式細(xi)胞(bao)(bao)(bao)術。

流(liu)式細胞術的直接(jie)與間接(jie)染色

直接：直接偶(ou)聯抗體(ti)

可直接(jie)多重分析來自同一(yi)宿(su)主的抗體

由于孵育和洗滌步驟(zou)更少(shao)，因此實驗步驟(zou)更快

能(neng)夠(gou)在一項檢測中使用許多不同的抗體，從而能(neng)夠(gou)同時讀取大量終點(dian)

間接：非偶(ou)(ou)聯一抗 + 偶(ou)(ou)聯二(er)抗

可改善以低豐度存在的靶標的檢(jian)測，同時(shi)由于(yu)二次放大可提(ti)供更高的靈敏度（多個二抗結合(he)一(yi)個一(yi)抗）

當直接偶聯(lian)物(wu)尚未(wei)獲(huo)得時，有益于一(yi)抗的初始驗證

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