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當細胞破碎的(de)時候，蛋(dan)白(bai)(bai)水(shui)解酶就會被(bei)釋放(fang)出來或被(bei)激(ji)活，使電(dian)泳結(jie)(jie)果復雜(za)化，影響最終(zhong)結(jie)(jie)果分析。為了避免這些情(qing)況(kuang)的(de)出現(xian)，建議在樣(yang)品(pin)制備(bei)時盡可能(neng)在低溫下進行(xing)。此(ci)外，許(xu)多蛋(dan)白(bai)(bai)酶在PH9以上就(jiu)失活了，因此(ci)Tris堿，碳酸鈉或堿性載(zai)體(ti)兩性電解質(zhi)往往能(neng)抑(yi)制(zhi)蛋白(bai)(bai)(bai)水解。但是(shi)有(you)些蛋白(bai)(bai)(bai)酶(mei)在上述(shu)條件下仍然保(bao)持著活性，此(ci)時應當使用蛋白(bai)(bai)(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑。因此(ci)對于我們想要研究(jiu)的蛋白(bai)(bai)(bai)來說，選擇(ze)性和(he)有(you)效的抑(yi)制(zhi)這(zhe)些蛋白(bai)(bai)(bai)酶(mei)對于蛋白(bai)(bai)(bai)純(chun)化路(lu)線設計來說顯得尤為重要。
蛋白(bai)(bai)酶(mei)抑制劑與蛋白(bai)(bai)酶(mei)一樣(yang)，都是紛繁復(fu)雜的，通(tong)常使用(yong)許多化學(xue)物(wu)質作為蛋白(bai)(bai)酶(mei)抑制劑，如PMSF 和leupeptin。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對某一類蛋白酶起作用，因此通常建議復合使用蛋白酶抑制劑，如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒"，見下表（來自《蛋白質電泳實驗技術》）。
蛋(dan)白酶抑制劑 | 有效抑制的酶 |
PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是(shi)很常見的抑制劑(ji)，使用濃(nong)度為1mmol/L | 不可逆抑(yi)制絲氨酸(suan)水(shui)解酶(mei)(mei)和一些(xie)半胱氨酸(suan)水(shui)解酶(mei)(mei)。 |
AEBSF 絲氨(an)酸抑制(zhi)劑(ji)，使用濃度為4mmol/L | AEBSF的(de)抑制活性與PMSF相近，但(dan)它更易溶于水(shui)而且毒(du)性低 |
EDTA，EGTA，使用濃度為1mmol/L | 通過鰲合(he)蛋(dan)白酶維持(chi)活(huo)性所(suo)必需的金屬離子(zi)來抑制金屬蛋(dan)白酶。 |
多肽蛋白酶抑制劑，使用濃度為2-20ug/ml | 亮肽(tai)素（Leupeptin）能抑(yi)制(zhi)(zhi)多(duo)種絲(si)氨(an)酸(suan)和半胱氨(an)酸(suan)蛋(dan)白酶(mei)(mei)(mei)；抑(yi)肽(tai)素（pepstatin）抑(yi)制(zhi)(zhi)天冬(dong)氨(an)酸(suan)蛋(dan)白酶(mei)(mei)(mei)；抑(yi)肽(tai)酶(mei)(mei)(mei)（aprotinin）能抑(yi)制(zhi)(zhi)許多(duo)絲(si)氨(an)酸(suan)蛋(dan)白酶(mei)(mei)(mei)；苯丁抑(yi)制(zhi)(zhi)劑（bestatin）能抑(yi)制(zhi)(zhi)氨(an)基酸(suan)多(duo)肽(tai)酶(mei)(mei)(mei) |
TLCk，TPCK，使用濃度為0.1-0.5mmol/L | 不可逆的(de)抑制絲氨酸(suan)和半胱氨酸(suan)的(de)蛋(dan)白(bai)酶 |
芐脒（Benzamidine）使用濃度(du)為(wei)1-3mmol/L | 抑制絲氨酸蛋白(bai)酶(mei) |
但是(shi)這(zhe)樣配(pei)置(zhi)溶液進行處理，有(you)時(shi)也是(shi)頗為麻煩，而(er)且(qie)效果(guo)可能并不(bu)好(hao)，目前(qian)有(you)一些(xie)廠家試劑在簡便(bian)操作，和抑制(zhi)效果(guo)方(fang)面有(you)不(bu)俗的表現，可以考慮在實驗中選用(yong)，節約時(shi)間(jian)和便(bian)于結(jie)果(guo)分析。
比如(ru)，G-Biosciences的ProteaseArrest™蛋白酶抑制劑也許就能滿足(zu)這(zhe)種需要，ProteaseArrest™是一(yi)種常規的蛋白酶抑制劑混合(he)物，提供(gong)100X濃縮的(de)即用(yong)溶(rong)液。這種(zhong)100X濃度(du)的溶液適(shi)用于小量，分析樣本(ben)的應用。在1ml樣本(ben)中加(jia)入10微升(sheng)的ProteaseArrest可(ke)以達到大于95%的抑制效(xiao)率。對(dui)于樣(yang)本(ben)中含量高的蛋白酶的情況，可以適(shi)當增加(jia)ProteaseArrest的(de)(de)量來達到更大(da)的(de)(de)抑制效率(lv)。
抑制劑(ji)混合物包括針對絲氨(an)(an)酸、半胱(guang)氨(an)(an)酸、鈣蛋(dan)白(bai)酶(mei)和金屬蛋(dan)白(bai)酶(mei)可實現可逆和不(bu)可逆的抑制。可選(xuan)擇的EDTA的溶液可(ke)實現增強的金屬蛋白酶的抑制。EDTA并不存在于ProteaseArrest混(hun)合物溶液(ye)中(zhong)，它(ta)將抑制那些需要二價陽離子(zi)（Ca2+, Mg2+ 或Mn2+）來起作用的蛋白質的活性。除此之外(wai)，EDTA會抑制那些通過使用固定金屬親和層析色譜純化得到(dao)的(de)蛋(dan)白，也(ye)包(bao)括6XHis標簽(qian)重組蛋白。
由于各(ge)種抑制劑組分的(de)*化的(de)濃度，ProteaseArrest表(biao)現出(chu)優異的(de)蛋(dan)白酶(mei)活性的(de)抑制，因而它(ta)適合(he)在(zai)從動物組織(zhi)，酵母，植物和(he)細菌(jun)中進行蛋(dan)白純化和(he)樣(yang)本制備(bei)過程中來保護蛋(dan)白。
ProteaseArrest也有獨立包裝的小包裝，能(neng)夠在(zai)10ml的溶液中達(da)到(dao)大于(yu)95%的抑制效率(lv)。這種OneQuant™小包裝(zhuang)主要是(shi)為了科(ke)研(yan)人員(yuan)方便使(shi)用。
實重要的(de)是ProteaseArrest也可(ke)以根據實驗的情況來優化蛋白(bai)(bai)酶抑制劑的濃度，比如組織中含有(you)高于常規量(liang)的蛋白(bai)(bai)酶的時(shi)候(hou)，可(ke)以加入2X或者更(geng)高(gao)濃(nong)度的ProteaseArrest的(de)量。
在研究中，發現1X濃度的ProteaseArrest的蛋白酶抑制效(xiao)率達到(dao)了95%（0.5mg/ml的小鼠(shu)的胰腺提(ti)取物為(wei)例(li)）。
除了蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑以外，在(zai)許多研(yan)究過程中，尤其是一些制(zhi)藥公司和(he)研(yan)究院在(zai)研(yan)究藥理學機制(zhi)的時候，需要了解蛋(dan)白(bai)磷酸化(hua)途徑，因(yin)此一個重(zhong)要的步驟就是準確的觀察一般和(he)特異的磷酸化(hua)狀(zhuang)態(tai)，所以蛋白抽(chou)提的另一個重要保護過程(cheng)就是對磷酸(suan)化狀態的有(you)效保護。
磷酸化(hua)的(de)蛋白可以被非特異性(xing)(xing)的(de)磷酸酶（例如：堿性(xing)(xing)磷酸酶），特異性(xing)(xing)的(de)絲(si)氨酸/蘇(su)氨酸磷酸酶、酪(lao)氨酸蛋白磷酸酶或雙重特異性磷酸酶去磷酸化。針對這種情況G-Biosciences也推出了一種PhosphataseArrest™磷酸酶抑制(zhi)劑混合物(wu)，它能(neng)夠保持細(xi)胞和組織(zhi)中(zhong)蛋白(bai)的磷酸化狀態。PhosphataseArrest™包括3種抑(yi)制劑產品。
phosphataseArrest™ I
一(yi)種廣(guang)泛的磷酸酶(mei)抑制劑(ji)混合物(wu)包括5種磷(lin)酸酶抑制劑，能夠特(te)異性(xing)的抑制絲(si)氨(an)酸/蘇(su)氨酸，和酪氨酸雙(shuang)重(zhong)特(te)異性的磷酸酶。PhosphataseArrest™ I是一種穩定(ding)的溶液組成，含(han)有氟化鈉(na)，正(zheng)釩(fan)酸鈉(na)，焦磷酸鈉(na)，β-磷酸(suan)甘油，鉬酸(suan)鹽等。
磷酸酶(mei)抑制(zhi)劑(ji) | 分子量(liang) | 靶向(xiang)磷酸酶 |
氟化鈉(na) | 42 | 酸(suan)性(xing)磷酸(suan)酶(mei) |
正釩酸(suan)鈉 | 183.9 | 酪氨(an)酸(suan)磷酸(suan)酶(mei)，堿性磷酸(suan)酶(mei) |
焦磷酸鈉(na) | 221.94 | 絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
β-磷(lin)酸甘油 | 306.1 | 絲(si)氨(an)酸/蘇氨(an)酸磷(lin)酸酶 |
鉬酸鹽(yan) | 205.92 | 酸性(xing)磷(lin)酸酶(mei) |
PhosphataseArrest™ II
一種(zhong)廣泛(fan)的磷(lin)酸(suan)酶抑制劑混合物(wu)包括5種磷(lin)酸(suan)酶(mei)的抑(yi)制劑能夠抑(yi)制酸(suan)性，堿性和(he)酪(lao)氨酸(suan)磷(lin)酸(suan)酶(mei)。PhosphataseArrest™ II含有優化濃(nong)度的氟化鈉(na)，酒(jiu)石酸(suan)(suan)鈉(na)，正釩酸(suan)(suan)鈉(na)，咪唑(zuo)和鉬酸(suan)(suan)鹽(yan)。
磷酸酶抑(yi)制劑 | 分子量 | 靶向磷(lin)酸(suan)酶 |
氟化(hua)鈉 | 42 | 酸(suan)性磷(lin)酸(suan)酶 |
正釩(fan)酸鈉 | 183.9 | 酪氨(an)酸(suan)磷(lin)酸(suan)酶(mei)，堿性磷(lin)酸(suan)酶(mei) |
酒(jiu)石酸(suan)鈉 | 230.08 | 酸(suan)性(xing)磷酸(suan)酶 |
咪唑 | 68.08 | 堿(jian)性(xing)磷酸酶 |
鉬酸鹽(yan) | 205.92 | 酸性(xing)磷酸酶 |
PhosphataseArrest™ III
一(yi)種(zhong)廣泛的磷酸(suan)酶抑制劑混合物包括3種磷酸酶的抑制(zhi)劑能夠抑制(zhi)堿(jian)性(xing)和絲氨酸/蘇氨(an)酸磷(lin)酸酶。PhosphataseArrest™ III是一種穩定的，方便的溶液(ye)，由(you)斑蝥素(su)，對溴四咪唑草酸鹽和腫瘤促進劑組成。
磷酸(suan)酶(mei)抑制劑 | 分子量 | 靶向磷(lin)酸(suan)酶 |
斑蝥素 | 196.2 | 絲氨(an)酸(suan)/蘇氨(an)酸(suan)磷(lin)酸(suan)酶(mei) |
對溴四咪唑草酸鹽 | 373.23 | 堿性(xing)磷(lin)酸酶 |
腫瘤促進劑 | 1009.17 | 絲氨(an)酸/蘇氨(an)酸磷酸酶(mei) |
總(zong)而(er)言(yan)之，在(zai)實驗(yan)中適當的(de)選擇一些經過(guo)嚴(yan)格的(de)質(zhi)量監控的(de)產品，想來相比較于家制的(de)雞(ji)尾酒(jiu)而(er)言(yan)具有更(geng)(geng)好的(de)使用(yong)(yong)重復性(xing)，和有效性(xing)，讓我們在(zai)下游應用(yong)(yong)中得到更(geng)(geng)潔凈和清晰的(de)結果。
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